Возможности применения анализа внеклеточной ДНК в ранней диагностике патологий беременности

Цель. Изучить корреляцию уровня внеклеточной ДНК с особенностями течения беременности пациенток, а также оценить потенциал разработанной технологии неинвазивного пренатального скрининга (НИПС) для ранней диагностики акушерских патологий.

Дизайн. Проспективное наблюдательное исследование.

Материалы и методы. Исследование выполнено на выборке из 620 женщин с одноплодной беременностью сроком гестации свыше 9 недель. Для проведения НИПС применялось полупроводниковое секвенирование с последующей биоинформатической обработкой данных, включая расчет фетальной фракции (ФФ) по оригинальному алгоритму, выполненному в соответствии с патентом № 2712175 «Способ неинвазивного пренатального скрининга анеуплоидий плода».

Результаты. Медианный уровень внеклеточной фетальной ДНК в исследуемой когорте составил 11,7 [9,47–14,01]%. Значимой связи ФФ с развитием преэклампсии, гестационного сахарного диабета, преждевременных родов и задержки роста плода не установлено (p > 0,05).

Заключение. Полученные данные подчеркивают необходимость дальнейших исследований динамики ФФ с привязкой к сроку беременности и клиническим вариантам патологий на более крупной выборке для повышения клинической эффективности скрининга.

Ключевые слова: беременность, внеклеточная ДНК, внеклеточная фетальная ДНК, неинвазивный пренатальный скрининг, НИПС, ранняя диагностика, фетальная фракция

Скачать PDF

Тарасенко О.А., Вашукова Е.С., Мальцева А.Р., Моршнева А.В., Беспалова О.Н., Глотов А.С. Возможности применения анализа внеклеточной ДНК в ранней диагностике патологий беременности. 2026. № 1 (70). DOI: 10.31550/2712-8598-2026-1-3-ZhZiR. URL: https://journalgynecology.ru/statyi/vozmozhnosti-primeneniya-analiza-vnekletochnoj-dnk-v-rannej-diagnostike-patologij-beremennosti/(дата обращения: дд.мм.гггг)

O.A. Tarasenko¹, E.S. Vashukova¹, A.R. Maltseva¹, A.V. Morshneva², O.N. Bespalova¹, A.S. Glotov¹

¹ Research Institute of Obstetrics, Gynecology and Reproductology named after D.O. Ott; Saint Petersburg, Russian Federation

² LLC "NIPT"; Saint Petersburg, Russian Federation

 

Abstract

Aim. To study the correlation between extracellular DNA levels and the course of pregnancy in patients, as well as to assess the potential of the developed non-invasive prenatal screening (NIPS) technology for the early diagnosis of obstetric pathologies.

Design. A prospective observational study.

Materials and methods. The study was conducted on a sample of 620 women with singleton pregnancies at a gestational age of more than 9 weeks. Semiconductor sequencing followed by bioinformatic data processing was used for NIPS. This included the calculation of the fetal fraction (FF) using an original algorithm developed in accordance with patent No. 2712175, "Method for non-invasive prenatal screening of fetal aneuploidies".

Results. The median level of extracellular fetal DNA in the study cohort was 11.7% [9.47–14.01]%. We found no significant association of the fetal fraction with the development of preeclampsia, gestational diabetes mellitus, preterm birth, or fetal growth restriction (p > 0.05).

Conclusion. The obtained data highlight the need for further research into the dynamics of the fetal fraction in relation to gestational age and specific clinical types of pathologies in a larger sample to improve the clinical effectiveness of screening.

Keywords: non-invasive prenatal screening, NIPS, extracellular DNA, extracellular fetal DNA, fetal fraction, pregnancy, early diagnosis.

О.А. Тарасенко¹, Е.С. Вашукова¹, А.Р. Мальцева¹, А.В. Моршнева², О.Н. Беспалова¹, А.С. Глотов¹

¹ ФГБНУ «Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии имени Д.О. Отта»; Россия, г. Санкт-Петербург

² ООО «НИПТ»; Россия, г. Санкт-Петербург

 

Современная пренатальная диагностика базируется на широком внедрении неинвазивного пренатального скрининга (НИПС), который прочно занял место высокоточного метода оценки риска хромосомных аномалий плода. В основе технологии лежит анализ внеклеточной ДНК (вкДНК), циркулирующей в плазме крови беременной женщины [1]. Значительную часть этого пула составляет ДНК плодного происхождения (вкфДНК), высвобождающаяся в материнский кровоток преимущественно в результате апоптоза клеток трофобласта [2]. После родоразрешения вкфДНК быстро элиминируется из кровотока матери [3], что подтверждает ее плацентарный генез, как и отсутствие циркулирующей ДНК плода в случаях плацентарного мозаицизма [4, 5]. Помимо физиологического апоптоза, вклад в высвобождение нуклеиновых кислот могут вносить некротические процессы, индуцированные патологическими состояниями [6].

Поскольку физическое разделение материнской и фетальной вкДНК невозможно, ключевым параметром, определяющим чувствительность и специфичность НИПС, является фетальная фракция (ФФ) — относительное содержание вкфДНК в общем пуле вкДНК. ВкфДНК детектируется в материнской плазме с 4-й недели гестации, а ее концентрация прогрессивно увеличивается. К 9–10-й неделе беременности ФФ достигает диагностически значимых значений (5–20%), минимально необходимый порог для проведения надежного скрининга при одноплодной беременности составляет 4,0 [1,0; 3,0]%. Наиболее эффективным методом анализа вкДНК является высокопроизводительное секвенирование [7], которое позволяет не только количественно оценить ФФ, но и детектировать хромосомные анеуплоидии.

В настоящее время исследования вкДНК вышли далеко за рамки определения хромосомных аномалий плода. Перспективным направлением является использование вкДНК для прогнозирования и ранней доклинической диагностики основных акушерских осложнений, где акцент смещается с анализа количества хромосом на исследование качественных характеристик плацентарной ДНК.

Целью настоящей работы является определение диагностической значимости показателя вкДНК в роли биомаркера для ранней диагностики осложнений гестационного периода.

 

Материалы и методы

В период с декабря 2019 г. по май 2022 г. на базе ФГБНУ «НИИ АГиР им. Д.О. Отта» (г. Санкт-Петербург) проведено проспективное наблюдательное исследование, включавшее 5459 женщин, которым был выполнен НИПС. Все женщины подписали добровольное информированное согласие на использование результатов НИПС в научно-исследовательских целях.

Критерии включения: одноплодная беременность; срок беременности более 9 недель; результат НИПС получен после первичного исследования; информированное согласие на участие в исследовании. Критерии исключения: уровень ФФ менее 4,0% после первичного исследования; сомнительный результат НИПС после первичного исследования, образцы не прошли контроль качества после первичного поступления в лабораторию; отказ от участия в исследовании.

Для анализа влияния осложнений беременности на ФФ среди пациенток с низким риском по результатам НИПС случайным образом были отобраны 675 женщин, у которых собирали информацию о течении беременности и сопутствующих осложнениях. У 55 из них эту информацию получить не удалось, поэтому они были исключены из исследования. Критериями отбора стали данные о течении и исходах беременности, а также подтверждение со слов женщин отсутствия хромосомных аномалий у новорожденных.

Таким образом, исследуемую когорту составили 620 пациенток, у которых были собраны сведения об исходах беременности после завершения беременности родами, а также получено фенотипическое подтверждение отсутствия хромосомной аномалии у новорожденных. Осложнения различного генеза диагностированы у 212 (34,2%) пациенток, у 408 (65,8%) женщин беременность протекала без осложнений — они составили группу сравнения.

Для проведения НИПС использовались образцы плазмы крови. Выделение вкДНК проводили коммерческими наборами. Библиотеки подготовленных фрагментов ДНК секвенировали на полупроводниковом секвенаторе. Последующая биоинформатическая обработка данных, включая расчет ФФ, проводилась в соответствии с ранее разработанным оригинальным алгоритмом, выполненным согласно патенту^[1].

Статистическая обработка данных производилась с использованием программы GraphPad Prism version 20.109 (GraphPad Software, США). Для качественных признаков рассчитывали их долю (%). Значимость различий между группами по качественным признакам оценивали с помощью двустороннего точного критерия Фишера. Проверку количественных признаков на нормальность проводили при помощи критерия Шапиро — Уилка. Все переменные имели распределение, отличное от нормального, поэтому для них определяли медиану (Me), нижний квартиль (Q1) и верхний квартиль (Q3). Корреляционный анализ проводили с использованием критерия (r) Спирмена. Для множественных сравнений по количественным переменным использовали непараметрический критерий Краскела — Уоллиса и тест Данна для попарного сравнения. Для всех тестов статистически значимыми считали различия при р < 0,05.

 

Результаты

Медианный уровень вкфДНК в исследуемой когорте составил 11,7 [9,47–14,01]%. Согласно собранным данным, беременность протекала без осложнений у 408/620 (65,8%) женщин, у 212/620 (34,2%) пациенток диагностированы различные осложнения беременности, включая преэклампсию (62/620; 10,0%), гестационный сахарный диабет (87/620; 14,1%), задержку развития плода (37/620; 5,9%), преждевременные роды (26/620; 4,2%).

В ходе исследования нами не обнаружено значимых различий (p = 0,2001) в уровне ФФ между женщинами с такими осложнениями беременности, как преэклампсия, гестационный сахарный диабет, преждевременные роды и задержка роста плода, и беременными без патологии (группой сравнения) (p > 0,05) (рис.).

 

Рис. Фетальная фракция внеклеточной ДНК (вкДНК) в плазме крови беременных в зависимости от осложнений беременности (p = 0,2001)

 

Обсуждение

Данные литературы свидетельствует о значительном диагностическом потенциале качественного анализа вкДНК. В последние годы предпринимались попытки использования ФФ как предиктора патологических состояний при беременности. Согласно ряду публикаций, изменения уровня ФФ при осложнениях незначительны, в то время как в других работах сообщается о существенных отклонениях. Более того, отмечено, что повышенный уровень общей вкДНК ассоциирован с неблагоприятными клиническими исходами (артериальной гипертензией, тромбоцитопенией, преждевременными родами, задержкой роста плода) и высоким уровнем прогипертензивных факторов (sFLT-1, sЭндоглина, MMP-2). Эти данные являются шагом на пути к утверждению вкДНК в качестве диагностического инструмента и подчеркивают необходимость дальнейшего изучения ее роли при гестационных процессах [8]. Низкая доля фетальной ДНК у бессимптомных женщин может служить предиктором последующей плацентарной дисфункции и гипертензивных расстройств [9].

Патогенез преэклампсии связан с нарушением инвазии трофобласта и плацентарной ишемией, что приводит к усиленному апоптозу и некрозу трофобласта и, как следствие, к массивному выбросу плацентарной вкДНК. Исследования показывают, что аномальное повышение уровня плацентарной вкДНК может служить предиктором развития преэклампсии за несколько недель до манифестации клинических симптомов [8, 9].

В отличие от преэклампсии, при плацентарной недостаточности может наблюдаться снижение уровня плацентарной вкДНК, отражающее уменьшение функциональной массы трофобласта. Мониторинг динамики ФФ в сочетании с данными ультразвуковой допплерометрии потенциально позволяет идентифицировать группу риска по задержке роста плода [10].

Многофакторность этиологии преждевременных родов (инфекция, воспаление) определяет необходимость поиска специфических маркеров. Перспективным направлением является анализ профилей фрагментации и эпигенетических меток вкДНК, ассоциированных с воспалительными процессами в плаценте и плодных оболочках. Так, на ранних сроках беременности низкая фетальная доля ассоциирована с повышенным риском неблагоприятных исходов [11].

НИПС позволяет выявить хромосомные аномалии, лежащие в основе ~50–60% выкидышей в I триместре. Кроме того, резкое снижение или исчезновение ФФ в динамике является неблагоприятным прогностическим маркером, предвещающим остановку развития беременности [12].

Существуют и противоположные данные: в ряде работ не выявлено значимых различий в концентрации вкфДНК у женщин с преэклампсией по сравнению с контрольной группой. В одном из таких исследований, где измерение проводилось по гену SRY, статистически значимой разницы обнаружено не было [13]. Эти результаты находят подтверждение в других работах, показавших, что уровень вкфДНК также не отличался существенно между случаями нормальной и осложненной преэклампсией беременности [14, 15].

Вероятной причиной отсутствия выявленных взаимосвязей в нашей работе является ограниченный объем данных, обусловленный пилотным характером настоящего исследования. Как показывают литературные источники [16], при осложнениях беременности уровень ФФ может меняться в определенные сроки беременности и варьировать в зависимости от конкретного типа патологии. Таким образом, перспективным направлением для дальнейших исследований представляется анализ динамики ФФ с привязкой к сроку беременности и клиническим вариантам патологий на более крупной выборке.

 

Заключение

В настоящее время НИПС является надежным методом неинвазивной диагностики хромосомных аномалий. Несмотря на то, что в нашем исследовании не установлено прямой связи ФФ с конкретными осложнениями, будущее пренатальной диагностики связано с созданием комплексных неинвазивных тестов, которые по одному образцу крови матери позволят не только оценить кариотип плода, но и спрогнозировать риск развития акушерских осложнений (преэклампсии, задержки роста плода, преждевременных родов) на доклинической стадии. Это откроет путь к своевременной профилактике и персонализированному ведению беременности, что кардинально улучшит перинатальные исходы.

^[1] Козюлина П.Ю., Вашукова Е.С., Глотов А.С., Баранов В.С. и др. Способ неинвазивного пренатального скрининга анеуплоидий плода. Патент на изобретение RU 2712175 C1, 24.01.2020 г.

 

Источник финансирования

Исследование выполнено при финансовой поддержке ФНИ № 1024032800227-5-3.2.2.

1. Сухих Г.Т., Трофимов Д.Ю., Барков И.Ю., Шубина Е. и др. Методические рекомендации «Проведение неинвазивного пренатального ДНК-скринингаанеуплоидий плода по крови матери (НИПС) методом высокопроизводительного секвенирования». Акушерство и гинекология. 2024;3(Прил.):4–24. Sukhikh G.T., Trofimov D.Yu., Barkov I.Yu., Shubina J. et al. Methodological recommendations "Noninvasive prenatal screening (NIPS) for fetal aneuploidies in maternal blood by high-throughput sequencing (NGS)". Obstetrics and Gynecology. 2024;3(Suppl.):4–24. (in Russian). DOI: 10.18565/aig.2024.51
2. Faas B.H., De Ligt J., Janssen I., Eggink A.J. et al. Non-invasive prenatal diagnosis of fetal aneuploidies using massively parallel sequencing by ligation andevidence that cell-free fetal DNA in the maternal plasma originates from cytotrophoblastic cells. Expert Opin. Biol.Ther. 2012;12(Suppl.1):S19–26. DOI: 10.1517/14712598.2012.670632
3. Lo Y.M., Zhang J., Leung T.N., Lau T.K. et al. Rapid clearance of fetal DNA frommaternal plasma. Am. J. Hum. Genet. 1999;64(1):218–24. DOI: 10.1086/302205
4. Hahn S., Huppertz B., Holzgreve W. Fetal cells and cell free fetal nucleic acids in maternal blood: new tools to study abnormal placentation? Placenta. 2005;26(7):515–26. DOI: 10.1016/j.placenta.2004.10.017
5. Sifakis S., Koukou Z., Spandidos D.A. Cell-free fetal DNA and pregnancy-related complications (review). Mol. Med. Rep. 2015;11(4):2367–72. DOI: 10.3892/mmr.2014.311
6. Курцер М.А., Гнетецкая В.А. Диагностика хромосомных анеуплодий с помощью неинвазивного пренатального теста. Акушерство и гинекология. 2015;8:65–9. Kurtser M.A., Gnetetskaya V.A. A noninvasive prenatal test in the diagnosis of chromosome aneuploidies. Obstetrics and Gynecology. 2015;8:65–9. (in Russian)
7. Rather R.A., Saha S.C. Reappraisal of evolving methods in non-invasive prenatal screening: discovery, biology and clinical utility. Heliyon. 2023;9(3):e13923. DOI: 10.1016/j.heliyon.2023.e13923
8. Amaral L.M., Sandrim V.C., Kutcher M.E., Spradley F.T. et al. circulating total cell-free DNA levels are increased in hypertensive disorders of pregnancy and associated with prohypertensive factors and adverse clinical outcomes. Int. J.Mol. Sci. 2021;22(2):564. DOI: 10.3390/ijms22020564
9. Gerson K.D., Truong S., Haviland M.J., O'Brien B.M. et al. Low fetal fraction of cell-free DNA predicts placental dysfunction and hypertensive disease in pregnancy. Pregnancy Hypertens. 2019;16:148–53. DOI: 10.1016/j.preghy.2019.04.002
10. Xu C., Guo Z., Zhang J., Lu Q. et al. Non-invasive prediction of fetal growth restriction by whole-genome promoter profiling of maternal plasma DNA: a nested case-control study. BJOG. 2021;128(2):458–66. DOI: 10.1111/1471-0528.16292
11. Becking E.C., Scheffer P.G., Henrichs J., Bax C.J. et al. Fetal fraction of cell-free DNA in noninvasive prenatal testing and adverse pregnancy outcomes: a nationwide retrospective cohort study of 56,110 pregnant women. Am. J. Obstet. Gynecol. 2024;231(2):244.e1–18. DOI: 10.1016/j.ajog.2023.12.008
12. Pauta M., Martinez-Portilla R.J., Jara-Ettinger A.C., Ardiles-Ruesjas V. et al. Genome-wide cell-free DNA analysis for aneuploidy detection in miscarriages: test performance meta-analysis. Prenat. Diagn. 2025;45(8):957–67. DOI: 10.1002/pd.6824
13. Crowley A., Martin C., Fitzpatrick P., Sheils O. et al. Free fetal DNA is not increased before 20 weeks in intrauterine growth restriction or pre-eclampsia. Prenat. Diagn. 2007;27(2):174–9. DOI: 10.1002/pd.1645
14. Poon L.C., Musci T., Song K., Syngelaki A. et al. Maternal plasma cell-free fetal and maternal DNA at 11–13 weeks' gestation: relation to fetal and maternal characteristics and pregnancy outcomes. Fetal Diagn. Ther. 2013;33(4):215–23. DOI: 10.1159/000346806
15. Stein W., Müller S., Gutensohn K., Emons G. et al. Cell-free fetal DNA and adverse outcome in low risk pregnancies. Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. 2013;166(1):10–3. DOI: 10.1016/j.ejogrb.2012.09.006
16. Грачева М.И., Кан Н.Е., Красный А.М. Роль внеклеточной фетальной ДНК в ранней диагностике осложнений беременности. Акушерство и гинекология. 2016;10:5–10. Gracheva M.I., Kan N.E., Krasniy A.M. Role of cell-free fetal DNA in early diagnosis of pregnancy complications. 2016;10:5–10. (in Russian). DOI: 10.18565/aig.2016.10.5-10