Роль множественных внутриутробных гемотрансфузий в условиях резус-конфликта в формировании иммунного ответа плода

Цель исследования. Выявить особенности формирования иммунного ответа плода на множественные внутриутробные трансфузии в условиях резус-конфликта.

Дизайн исследования. Проспективное когортное сравнительное исследование.

Материалы и методы. В ходе исследования были проанализированы гематологические, биохимические и иммуннологические показатели пуповинной крови 36 плодов беременных с резус-сенсибилизацией, потребовавшей внутриутробных гемотрансфузий. Группу сравнения составили 47 женщин без резус-сенсибилизации, родоразрешенные в сроке преждевременных родов по другим показаниям, и их новорожденные. Проводилось гематологическое исследование пуповинной крови плодов и новорожденных. Методом проточной лазерной цитометрии определяли абсолютное и относительное количество лейкоцитов, лимфоцитов и их субпoпуляций (CD3⁺, CD4⁺, CD8⁺, CD4⁺/CD8⁺, CD19⁺, CD16⁺CD56⁺, CD23⁺CD3⁺, CD3⁺CD54⁺, CD3⁺CD95⁺), а также содержание C3- и С4-компонентов комплемента турбодиметрическим методом. Проведен анализ эффективности метода внутриутробного переливания крови. Выявлены особенности динамики отдельных показателей иммунного статуса плода до и после трансфузии, проявляющиеся увеличением уровня лейкоцитов, С3- и С4-компонентов комплемента, нарастанием численности клеток, обнаруживающих готовность к апоптозу (CD3⁺CD95⁺), на фоне снижения относительного содержания лимфоцитов и уровня естественных киллеров (CD16⁺CD56⁺) в пуповинной крови.

Заключение. Выявленные изменения свидетельствуют о провоспалительном эффекте гемотрансфузии плоду и активации реакции Т-клеточного звена иммунной системы, восстановлении цитотоксического потенциала и опсонизирующей функции крови.

Ключевые слова: внутриутробное переливание крови, гемолитическая болезнь плода, иммунологический статус плода

Устьянцева Н.Ю., Чистякова Г.Н., Путилова Н.В., Ремизова И.И. Роль множественных внутриутробных гемотрансфузий в условиях резус-конфликта в формировании иммунного ответа плода // Женское здоровье и репродукция. 2022. № 3 (54). URL: https://whfordoctors.su/statyi/rol-mnozhestvennyh-vnutriutrobnyh-gemotransfuzij-v-uslovijah-rezus-konflikta-v-formirovanii-immunnogo-otveta-ploda/(дата обращения: дд.мм.гггг)

The role of multiple intrauterine blood transfusions in conditions of Rh-conflict on the formation of the fetal immune response

N.Y. Ustyantseva, G.N. Chistyakova, N.V. Putilova, I.I. Remizova

Federal State Budgetary Institution “Urals Scientific Research Institute for Maternal and Child Care” of Ministry of Healthcare of Russian Federation; Russia, Yekaterinburg

Abstract

Study Objective: To reveal the features of the formation of the fetal immune response to multiple intrauterine transfusions in conditions of Rh conflict.

Study design. Prospective cohort comparative study. 

Materials and methods. In the course of the study, hematological, biochemical and immunological parameters of umbilical cord blood were analyzed in 36 fetuses of pregnant women with Rh-sensitization, which required intrauterine blood transfusions. The comparison group consisted of 47 women without Rh sensitization, delivered at the term of premature birth for other indications, and their newborns. Conducted hematological examination of cord blood of fetuses and newborns. The method of flow laser cytometry was used to determine the absolute and relative number of leukocytes, lymphocytes and their subpopulations (CD3+, CD4+, CD8+, CD4+/CD8+, CD19+, CD16+CD56+, CD23+CD3+, CD3+CD54+, CD3+CD95+), as well as the content of C3 and C4 complement components by turbodimetric method. The effectiveness of the method of intrauterine blood transfusion was analyzed. The features of the dynamics of individual indicators of the fetal immune status before and after transfusion were revealed, manifested by an increase in the level of leukocytes, C3 and C4 complement components, an increase in the number of cells that are ready for apoptosis (CD3+CD95+) against the background of a decrease in the relative content of lymphocytes and the level of natural killers (CD16+, 56+) in cord blood.

Conclusion. The revealed changes indicate a multidirectional effect of donor erythrocytes on the immune system of a fetus with hemolytic disease and require further study to establish a possible role in the effectiveness of intrauterine blood transfusion.

Keywords. Hemolytic disease of the fetus, intrauterine blood transfusion, immunological status of the fetus.

Н.Ю. Устьянцева, Г.Н. Чистякова, Н.В. Путилова, И.И. Ремизова

ФГБУ «Уральский научно-исследовательский институт охраны материнства и младенчества» Минздрава России; Россия, г. Екатеринбург

Гемолитическая болезнь плода и новорожденного (ГБПиН) продолжает оставаться одной из актуальных медико-социальных проблем. Широкое внедрение государственных программ профилактики резус-сенсибилизации в странах Европы и Америки насчитывает более 40 лет, что привело к существенному снижению количества иммунизированных женщин с резус-отрицательной принадлежностью крови до 0,1–0,3% [1–4]. В результате существенно снизились показатели заболеваемости и перинатальной смертности при ГБПиН.

В России ГБПиН диагностируется приблизительно у 0,6–1,0% новорожденных, при этом частота развития резус-изоиммунизации за последние годы не имеет существенной тенденции к снижению. Перинатальная смертность при ГБПиН составляет 0,037‰, а летальность — около 0,22% [5].

В основе патогенеза ГБПиН лежит разрушение эритроцитов плода материнскими антителами, проникающими через плацентарный барьер, приводящее к нарастанию анемии и уровня билирубина. Первоначально у плода происходит компенсаторное усиление эритропоэза в очагах экстрамедуллярного кроветворения (печень и селезенка) и формирования гипердинамического типа кровообращения. Впоследствии нарушаются основные функции печени, появляются гипопротеинемия, гипоонкия, прогрессирующая гипоксия, сердечная недостаточность, портальная гипертензия и ацидоз. Клинически выявляются признаки водянки, развивается генерализованный отек, наступает гибель плода [3].

«Золотым стандартом» лечения тяжелых форм анемии у плода при ГБПиН в антенатальном периоде является внутриутробное внутрисосудистое переливание крови (ВПК). Процедура проводится в сроках 18–34 нед гестации и повышает уровень гематокрита и гемоглобина до нормальных значений, что позволяет пролонгировать беременность до сроков, близких к доношенному. Количество переливаний, выполненных одному плоду, зависит от тяжести анемии, срока беременности, при котором их начинают проводить, и от скорости деградации перелитого гемоглобина.

ВПК, по сути, является трансплантацией аллогенной ткани плоду, находящемуся в состоянии гипоксии. Компоненты крови содержат множество иммуномодулирующих медиаторов, которые взаимодействуют и изменяют функцию иммунных клеток. Иммуномодуляция имеет двойную направленность: иммуносупрессивную и воспалительную. К воспалительным эффектам, вызванным трансфузией, относят праймирование лейкоцитов, усиление химиотаксиса нейтрофилов, активацию моноцитов/макрофагов и высвобождение воспалительных цитокинов. Иммуносупрессивные эффекты включают нарушение функции естественных киллеров, изменения в соотношении Т-лимфоцитов, дефектную презентацию антигена, подавление пролиферации лимфоцитов и снижение фагоцитарной функции макрофагов [6, 7].

Аспекты иммунологической модуляции вследствие трансфузий в основном изучались на взрослых пациентах, а также пациентах отделений реанимации педиатрического профиля [6–9]. Актуальным остается вопрос о процессе формирования иммунного ответа у плода под воздействием аллогенных эритроцитов донора в условиях внутриутробной толерантности и влияние этого процесса на эффективность ВПК.

Цель настоящего исследования — выявить особенности формирования иммунного ответа плода на множественные ВПК в условиях резус-конфликта.

Материалы и методы

В проспективное когортное сравнительное исследование вошли 36 беременных с тяжелой формой ГБПиН, потребовавшей проведения неоднократных ВПК, которые составили основную группу.

Перед каждым переливанием (в сроке гестации 24,0–31,6 нед) и при родоразрешении (в сроке гестации 32–36 нед) проводились общеклиническое исследование пуповинной крови плодов (подгруппа 1а) и новорожденных (подгруппа 1б) с определением уровня гемоглобина и гематокрита, а также расчет скорости деградации гемоглобина. Определяли абсолютное и относительное количество лейкоцитов, лимфоцитов и их субпoпуляций (CD3⁺, CD4⁺, CD8⁺, CD4⁺/CD8⁺, CD19⁺, CD16⁺CD56⁺, CD23⁺CD3⁺, CD3⁺CD54⁺, CD3⁺CD95⁺) методом проточной лазерной цитометрии, содержание C3- и С4-компонентов комплемента — турбидиметрическим методом. В сыворотке пуповинной крови оценивали уровень общего белка, альбумина, общего билирубина и его фракций.

Для проведения сравнительного анализа исследуемых параметров изучали аналогичные показатели пуповинной крови недоношенных новорожденных, родоразрешенных на соответствующем сроке гестации. В группу сравнения были включены 47 женщин без резус-сенсибилизации, родоразрешенные в сроке преждевременных родов по другим показаниям, и их новорожденные. Данная группа также была разделена на 2 подгруппы, соответствующие гестационному возрасту плодов и новорожденных основной группы: подгруппа 2а— дети от сверхранних преждевременных родов в 22,0–31,6 нед и подгруппа 2б — дети, рожденные в 32,0–36,6 нед гестации.

Первичный анализ полученных параметров с расчетом средних значений, стандартных ошибок для количественных переменных и частотного распределения для бинарных данных был выполнен с использованием программы Microsoft Ехсеl 2016. Сравнение зависимой выборки количественных данных до и после лечения проведено по парному критерию Стьюдента (t) и критерию Вилкоксона, сравнение независимых выборок — по критерию U Манна–Уитни, бинарных — по точному критерию F Фишера. Критерии Фишера и Манна–Уитни рассчитывали с использованием прикладных программ Statistica 13 и MedCalc 15.8. 

Результаты и обсуждение

Средний возраст пациенток основной группы и группы сравнения не различался (p ˃ 0,05) и составлял 33,7 ± 0,6 и 31,2 ± 0,8 года соответственно.

Первое ВПК проводилось в 26,2 ± 0,6 нед гестации, а среднее количество процедур составляло 3,2 ± 0,2. В целом количество процедур ВПК колебалось от 2 до 7. Всего было проведено 116 процедур ВПК.

При сравнении гематологических показателей до начала ВПК у детей основной группы выявлено статистически значимое снижение уровня гемоглобина и гематокрита (табл. 1). Уровень общего билирубина, напротив, был статистически значимо выше, чем у детей группы сравнения, вследствие повышенного гемолиза эритроцитов. Объем переливаемой крови плоду при процедуре ВПК определялся исходным уровнем гематологических показателей у плода, гестационным сроком и гематокритом донорской крови. В качестве трансфузионной среды использовались отмытые донорские эритроциты, приготовленные из лейкоредуцированной с использованием лейкофильтров фирмы Hemonetics эритроцитной взвеси со сроком хранения до 5 сут. Лейкоредукция крови позволяет увеличить инфекционную безопасность гемотрансфузии путем снижения риска передачи лейкоцит-ассоциированных вирусов от донора к реципиенту, а также ослабляет иммуногенные свойства компонентов крови. В дальнейшем лейкоредуцированная эритроцитная взвесь подвергалась четырехкратному отмыванию физиологическим раствором. В среднем за одну процедуру ВПК переливали 44,8 ± 2,9 мл отмытых донорских эритроцитов.

Таблица 1. Сравнительный анализ гематологических и биохимических показателей пуповинной крови плодов и новорожденных с исследуемых групп (M ± m)

Примечание. *р < 0,05 — статистически значимые различия с группой сравнения того же срока гестации; ^р < 0,05 — статистически значимые различия с показателями до ВПК.

В результате проведения ВПК показатели гемоглобина и гематокрита у детей основной группы при рождении увеличились в 2,0 и 1,9 раза (р < 0,010 в обоих случаях). Однако по сравнению с таковыми новорожденных без ГБПиН они оставались статистически значимо ниже, что свидетельствовало о сохраняющейся анемии и подтверждалось нарастанием концентрации общего билирубина.

Средняя скорость деградации гемоглобина между 1-м и 2-м ВПК составила 7,8 ± 1,1 г/л в сутки (рисунок). Однако в дальнейшем этот показатель снижался, что влекло за собой увеличение интервалов между процедурами.

Рис. Динамика скорости деградации гемоглобина и интервалов между процедурами ВПК.

При анализе показателей иммунного статуса до проведения ВПК плодам с ГБПиН выявлено увеличение относительной численности лимфоцитов (табл. 2).

Таблица 2. Сравнительный анализ иммунологических показателей пуповинной крови и новорожденных исследуемых групп (M ± m)

Примечание. *р < 0,05 — статистически значимые различия с группой сравнения того же срока гестации; ^р < 0,05 — статистически значимые различия с показателями до ВПК.

Состояние В-клеточного звена иммунной системы характеризовалось статистически значимым повышением относительного содержания CD19⁺-лимфоцитов. Одновременно с этим регистрировалось достоверное уменьшение численности CD8⁺— и CD16⁺CD56⁺-клеток, что указывало на снижение цитотоксического потенциала, вызванное стресс-индуцированной мобилизацией клеток на фоне тяжелой гипоксии [10]. Содержание Т-лимфоцитов, экспрессирующих рецептор апоптоза СD95, у детей основной группы не отличалось от показателей группы сравнения.

При анализе показателей гуморального звена отмечалось достоверное снижение С3-компонента комплемента (р = 0,0001), что отражало сниженную способность к опсонизации, хемотаксису, фагоцитозу и цитолизу чужеродных антигенов в условиях ГБПиН.

После проведения множественных ВПК у детей основной группы в 1-е сутки жизни наблюдалось статистически значимое увеличение абсолютного количества лейкоцитов пуповинной крови относительно первоначального уровня (до ВПК). Статистически значимо уменьшалось относительное содержание лимфоцитов, повышалась цитотоксическая активность CD8⁺-клеток. Параллельно с этим наблюдалось достоверное увеличение С3- и С4-компонентов комплемента относительно их уровня до ВПК — в 1,5 и 1,9 раза соответственно. В результате этого данные показатели к моменту рождения не отличались от таковых группы сравнения. Несмотря на достижение некоторых показателей иммунитета уровня детей без ГБПиН, у новорожденных после ВПК сохранялось повышенное содержание В-лимфоцитов и отмечалось увеличение относительного числа CD3⁺— и CD4⁺-клеток. Повышенное содержание CD3⁺CD95⁺-лимфоцитов, обнаруживающих готовность к апоптозу у новорожденных с ГБПиН, указывало на сохранение защитных механизмов иммунной системы, направленных на элиминацию агрессивных клонов Т-лимфоцитов, возникающих в результате иммунного гемоконфликта.

Выявленные изменения свидетельствуют о провоспалительных эффектах ВПК и активной реакции иммунной системы плода на чужеродный антиген.

Таким образом, иммуномодулирующий эффект множественных ВПК заключается в активации Т-клеточного звена иммунной системы (CD3⁺— и CD4⁺-лимфоцитов), восстановлении цитотоксического потенциала CD8⁺-клеток и опсонизирующей функции крови (С3-компонент комплемента).

Заключение

Проведенное нами исследование доказывает высокую эффективность метода ВПК плоду с целью лечения ГБПиН, позволяющего пролонгировать его внутриутробное развитие и снижать перинатальные потери. Тем не менее дискутабельным остается вопрос об интервалах проведения повторных ВПК и времени родоразрешения после них. Поиску предикторов, решающих эту проблему, посвящено множество исследований [11–13], однако ни одно из них не учитывает иммунологический характер нарушений, лежащих в основе заболевания.

Иммунитет плода — это «комплексная система бдительности», а не молчаливая, наблюдательная и незрелая организация, которая обладает способностью вызывать быструю, но разумную и избирательную реакцию на различные воздействия, в том числе гемотрансфузию. Обнаруженные нами изменения иммунных параметров новорожденных после множественных процедур ВПК укладываются в двунаправленную концепцию иммуномодуляции, вызванной гемотрансфузией.

1. Visser G.H.A., Di Renzo G.C., Spitalnik S.L. et al. The continuing burden of Rh disease 50 years after the introduction of anti-Rh(D) immunoglobin prophylaxis: call to action. Am. J. Obstet. Gynecol. 2019; 221: e1–227.e4. DOI: 10.1016/j.ajog.2019.05.019
2. Baskett T.F. From tragedy to triumph: canadian connections in the management of rhesus hemolytic disease of the newborn. J. Obstet. Gynaecol. Can. 2019; 41: S207–S214. DOI: 10.1016/j.jogc.2019.08.038
3. Sahoo T., Sahoo M., Gulla K.M. et al. Rh alloimmunisation: current updates in antenatal and postnatal management. Ind. J. Pediatr. 2020; 87: 1018–1028. DOI: 1007/s12098-020-03366-0
4. Устьянцева Н.Ю., Путилова Н.В, Чистякова Г.Н. Современные подходы к диагностике и терапии резус-сенсибилизации. Лечение и профилактика. 2020; 10(2): 89–94. [Ustyantseva N.Yu., Putilova N.V., Chistyakova G.N. Modern approaches to the diagnosis and therapy of Rh sensitization. Treatment and prevention. 2020; 10(2): 89–94. (in Russian)]
5. Клинические рекомендации. Резус иммунизация. Гемолитическая болезнь плода. М.; 2020. [Clinical guidelines. Rh immunization. Hemolytic disease of the fetus. Moscow; 2020. (in Russian)]
6. Muszynski J.A., Spinella P.C., Cholette J.M. et al. Transfusion-related immunomodulation: review of the literature and implications for pediatric critical illness. Transfusion. 2017; 57(1): 195–206. DOI: 10.1111/trf.13855
7. Remy K.E., Hall M.W., Cholette J. et al. Mechanisms of red blood cell transfusion-related immunomodulation. Transfusion. 2018; 58(3): 804–815. DOI: 10.1111/trf.14488
8. Dani C., Poggi C., Gozzini E. et al. Red blood cell transfusions can induce proinflammatory cytokines in preterm infants. Transfusion. 2017; 57(5): 1304–1310. DOI: 10.1111/trf.14080
9. Crawford T.M., Andersen C.C., Hodyl N.A. et al. Effect of washed versus unwashed red blood cells on transfusion-related immune responses in preterm newborns. Clin. Transl. Immunology. 2022; 11(3): e1377. DOI: 10.1002/cti2.1377
10. Чистякова Г.Н., Ремизова И.И., Устьянцева Л.С. и др. Особенности иммунного ответа недоношенных детей с бронхолегочной дисплазией различной степени тяжести. Медицинская иммунология. 2019; 21(3): 517–526. [Chistyakova G.N., Remizova I.I., Ustyantseva L.S. et al. Features of immune response in preterm babies with bronchopulmonary displasia of various severity. Meditsinskaya Immunologiya. 2019; 21(3): 517–526. DOI: 10.15789/1563-0625-2019-3-517-526
11. Abdelshafi S., Okasha A., Elsirgany S. et al. Peak systolic velocity of fetal middle cerebral artery to predict anemia in red cell alloimmunization in un-transfused and transfused fetuses. Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. 2021; 258: 437–442. DOI: 10.1016/j.ejogrb.2021.01.046
12. Martinez-Portilla R.J., Lopez-Felix J., Hawkins-Villareal A. et al. Performance of fetal middle cerebral artery peak systolic velocity for prediction of anemia in untransfused and transfused fetuses: systematic review and meta-analysis. Ultrasound Obste. Gynecol. 2019; 54(6): 722–731. DOI: 10.1002/uog.20273
13. Snelgrove J.W., D'Souza R., Seaward P.G.R. et al. Predicting intrauterine transfusion interval and perinatal outcomes in alloimmunized pregnancies: time-to-event survival analysis. Fetal Diagn. Ther. 2019; 46(6): 425–432. DOI: 10.1159/000499972